جمشید مشایخی در ششم آذرماه ۱۳۱۳ در تهران متولد شد و در سال ۱۳۳۶ به استخدام اداره تازه تاسیس هنرهای دراماتیک درآمد. او فعالیت هنری خود را پنجاه سال پیش با بازی در نمایشنامه «وظیفه پزشک» اثر پیراندلو آغاز کرد و برای اولین بار همراه فخری خوروش در سال ۱۳۴۲با بازی در فیلم کوتاه «جلد مار» ساخته هژیر داریوش، به سینما راه پیدا کرد. وی از اواخر دهه سی شمسی در حدود یکصد فیلم و ۷۰ تله فیلم و سریال تلویزیونی ایفای نقش کرده بود.
یکی از نمایش های مهم جمشید مشایخی، بازی در نقش «بزرگ آقا» در نمایش میراث کارِ بهرام بیضایی در تالار ۲۵ شهریور در آذر ماه ۱۳۴۶ بود.
از معروف‌ترین فیلم‌های او می‌توان به «خشت و آینه» از ابراهیم گلستان، «قیصر» ساخته مسعود کیمیایی، «گاو» کار داریوش مهرجویی، «ماه عسل» به کارگردانی فریدون گله و «سوته دلان» و «کمال الملک» هر دو اثر علی حاتمی اشاره کرد.
جمشید مشایخی پس از انقلاب بهمن ۵۷ مدتی رئیس اداره تئاتر بود. او در سال ۱۳۶۳برای بازی در دو فیلم گل های داوودی و کمال الملک، برندهٔ سیمرغ بلورین بهترین بازیگر نقش اول مرد جشنواره فیلم فجر شد.
از جمشید مشایخی یک دختر و دو پسر به جا مانده است. در سال‌های اخیر برخی از سخنان آقای مشایخی خبرساز شده بود. وی سال ۹۶ در جریان مراسم اهدای جوایز انجمن منتقدان و نویسندگان سینمایی از توجه زیاد منتقدان به عزت‌الله انتظامی، بازیگر هم نسلش، انتقاد کرده بود.
